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    小鼠胚胎MEF細(xì)胞的提取

    發(fā)布時(shí)間: 2023-01-06  點(diǎn)擊次數(shù): 1854次

    小鼠胚胎MEF細(xì)胞的提取步驟:

    1.將新鮮收獲的胚胎放入10厘米的細(xì)胞培養(yǎng)皿中

    2.用PBSA覆蓋胚胎,取出胎盤(pán)和其他母體組織

    3.切掉頭頂(眼睛及以上),取出內(nèi)臟

    4.保存頭部/卵黃囊進(jìn)行DNA分離以進(jìn)行基因分型檢測(cè)

    5.將胚胎體置于單獨(dú)的10厘米板中

    6.加入1mL胰蛋白酶,用刀片切碎成1mm的小碎片

    7.用酒精燈火焰對(duì)樣品之間的刀片進(jìn)行消毒

    8.將皿置于37°C培養(yǎng)箱中30-45分鐘(傾斜,使胰蛋白酶覆蓋細(xì)胞)

    9.通過(guò)在每口井中添加4mL MEF培養(yǎng)基(通常DMEM+10%FBS+1%G/A)來(lái)抑制typsin活性。

    10.用移液管10-20x吹打分離組織

    11將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到T75燒瓶或10cm平板上,并添加6-15mL MEF培養(yǎng)基

    12.讓細(xì)胞生長(zhǎng)融合(3-4天)

    13.抽出培養(yǎng)基,用10mL PBS沖洗

    14.加入3mL胰蛋白酶,在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-10min

    15.加入7mL MEF培養(yǎng)基進(jìn)行中和

    16.用移液管吸至離心管離心,使細(xì)胞重新懸浮

    17.將懸浮液轉(zhuǎn)移到2個(gè)T175燒瓶中,并向每個(gè)培養(yǎng)瓶中添加50mL MEF培養(yǎng)基

    18.讓細(xì)胞生長(zhǎng)融合(3-4天)

    19通過(guò)胰蛋白酶消化收獲細(xì)胞,冷凍細(xì)胞@3x106細(xì)胞/瓶,注意冷凍不能密度太稀,此細(xì)胞凍存后復(fù)蘇的存活會(huì)大量減少。

     

    備注:1.在細(xì)胞培養(yǎng)房中執(zhí)行細(xì)胞分離,并注意無(wú)菌操作,

          

    2. 建議使用含有血清的凍存液凍存。


    3. 原代分離培養(yǎng)請(qǐng)使用慶大霉素/兩性霉素溶液來(lái)防止細(xì)胞污染發(fā)生。

     

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