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    從組織培養(yǎng)細(xì)胞中制備粗微體的方法

    發(fā)布時(shí)間: 2021-11-17  點(diǎn)擊次數(shù): 1845次

    材料與儀器

    細(xì)胞
    環(huán)己酰亞胺 勻漿緩沖液
    培養(yǎng)皿

    步驟

    1. 培養(yǎng)基中加入環(huán)己酰亞胺(溶于蒸餾水,貯存液濃度 0.1 mol/L,-20℃ 保存。如果不溶,試著加熱到 40℃ 以幫助溶解)(終濃度 10 μmol/L),37℃ 保溫 5~10 分鐘。

    2. 培養(yǎng)皿從 37℃ 轉(zhuǎn)移到冷室,立即去掉培養(yǎng)基,用含有與培養(yǎng)基同樣環(huán)己酰亞胺濃度的冰冷 PBS 洗滌細(xì)胞 3 次,將培養(yǎng)皿口朝下倒立于紙巾上數(shù)分鐘,偶爾拍打。用 Kimwipe 紙巾擦掉側(cè)壁上殘留的 PBS。

    3. 加入 0.7 ml 含有 2~4 單位/ml RNase-IN (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) 的 HM,輕輕混旋培養(yǎng)皿以使 HM,能夠覆蓋培養(yǎng)皿的底面。

    勻漿緩沖液(HM):

    10 mmol/L HEPES-KOH 緩沖液,pH 7.5

    10 mmol/L KCl

    1 mmol/L MgCl2

    1 mmol/L DTT

    0.5 mmol/L PMSF

    4. 將培養(yǎng)皿取一定的角度,在 HM 中打濕橡皮或塑料淀帚,按同一方向?qū)⒓?xì)胞從培養(yǎng)皿的一邊刮到另一邊。

    5. 將刮取的細(xì)胞懸浮于 HM 中并集中到培養(yǎng)皿的一邊,打濕細(xì)胞淀帚以同樣的方法刮取培養(yǎng)皿其他部分的細(xì)胞,直到整個(gè)培養(yǎng)皿的細(xì)胞刮完(細(xì)胞刮走后培養(yǎng)皿的表面變得光滑)。用新鮮 HM 將玻璃吸管內(nèi)表面打濕(見(jiàn)第 4 步),將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到一個(gè)小的緊密配套的 Dounce 勻漿器中(Kontes)。

    6. 加 0.7 ml 新鮮 HM 到細(xì)胞已被刮掉的培養(yǎng)皿中,用細(xì)胞淀帚刮洗培養(yǎng)皿底部,將洗滌液轉(zhuǎn)移到另一培養(yǎng)皿中,用同樣的方法刮取細(xì)胞,將細(xì)胞懸浮液集中到 Dounce 勻漿器中。

    7. 當(dāng)兩到三個(gè)培養(yǎng)皿中的細(xì)胞懸浮液集中到一起以后,照下面的方法勻漿:

    (1) 以微小的角度握住 Dounce 勻漿器的管子立在桌子上。

    (2) 慢慢將玻璃研杵插入,直到研杵的頭部與細(xì)胞懸浮液表面接觸,沿管子的一邊用力將研杵上下推動(dòng)。

    (3) 重復(fù)步驟 (2),一上一下為一次共進(jìn)行 15~20 次杵擊。

    8. 細(xì)胞勻漿后立即用玻璃吸管將勻漿物轉(zhuǎn)移到一個(gè)試管中,并與 1/10 體積的 2.5 mol/L 蔗糖混合。

    9. 重復(fù) 3~ 8 步,直到所有培養(yǎng)皿中的細(xì)胞被勻漿。

    10. 測(cè)量勻漿物的體積。

    11. 在 Sorvall HB-4 轉(zhuǎn)頭(700 g ) 中 2100 r/min 離心 3 分鐘,增加速度到 6500 r/min(7000 g),再離心 10 分鐘。

    12. 轉(zhuǎn)移上清(PMS)到一個(gè)刻度量筒中并加 0.9 體積的 2.5 mol/L 蔗糖以得到終濃度力 1.33 mol/L 的蔗糖-PMS 混合液,或者加 2.2 體積的 2.5 mol/L 蔗糖以得到終濃度為 1.8 mol/L 的蔗糖-PMS 混合液。

    13. 在 SW41 轉(zhuǎn)頭離心管中準(zhǔn)備下列分級(jí)梯度(從下到上):

    梯度 a:

    1.5 ml 1.8 mol/L 的蔗糖-HM

    1.5 ml 含 2~4 單位/ml RNase-IN 的 1.5 moI/L 蔗糖-HM

    5 ml 蔗糖-PMS 混合物

    1.5 ml 1.0 mol/L 的蔗糖-HM

    1.5 ml 0.6 mol/L 的蔗糖-HM

    1 ml 0.25 mol/L 的蔗糖-HM

    梯度 b:

    5 ml 蔗糖-PMS 混合物

    1.5 ml 含 2~4 單位/ml RNase-IN 的 1.5 mol/L 蔗糖-HM

    1.5 ml 含 2~4 單位/ml RNase-IN 的 1.3 mol/L 蔗糖-HM

    1.5 ml 1.0 mol/L 的蔗糖-HM

    1.5 ml 0.6 mol/L 的蔗糖-HM

    1 ml 0.25 mol/L 的蔗糖-HM

    14. 在 SW41 轉(zhuǎn)頭中 4℃ 41000 r/min ( 最大 286500 g ) 離心 16 小時(shí)(梯度a ) 或離心至少 5 小時(shí)(梯度b)。

    15. 收集在 1.5 mol/L 和 1.8 mol/L 蔗糖層交界面形成的物質(zhì),這被認(rèn)為是重粗微體部分。

    16. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠孟铝蟹椒ㄖ械囊环N濃縮微體

    (1) 為了獲得好的多聚核糖體分離圖譜

    ① 用 0.1% SDS 溶液 100 倍稀釋一部分微體,測(cè)量 260 nm 和 280 nm 的吸收值。

    ② 估計(jì) 100 μl 微體是否含有足夠多的核糖體來(lái)展示多聚核糖體在蔗糖密度梯度中的分布圖。

    ③ 用 HM 5 倍稀釋樣品或 7 倍稀釋樣品,并用 SW41 轉(zhuǎn)頭在蔗糖線性密度梯度中進(jìn)行分析。

    (2) 為了收集沉淀

    ① 用 HM 3 倍稀釋樣品或 5 倍稀釋樣品。

    ② 根據(jù)樣品的體積在 Beckman Ti60 或 Ti50 轉(zhuǎn)頭中 40000 r/min ( 最大 160000 g) 離心 60~80 分鐘。

    (3) 為了用于體外翻譯和重建實(shí)驗(yàn)

    ① 用含 RNase 抑制劑的 HM 3 倍稀釋樣品或 5 倍稀釋樣品。

    ② 將稀釋的樣品加到 1.8 mol/L 蔗糖墊層溶液上,在 SW41 或 SW60 轉(zhuǎn)頭(轉(zhuǎn)頭的選擇取決于樣品的體積)中 35000 r/min ( 最大 210000 g)離心 60 分鐘。

    ③ 收集在墊層溶液上部形成的微體膜條帶,如果有必要用 SW60 轉(zhuǎn)頭進(jìn)一步濃縮到較小的體積中。


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