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原代細胞培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的方法
發(fā)布時間： 2021-07-07 點擊次數(shù)： 1531次原代培養(yǎng)原理將動物機體的各種組織從機體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用 EDTA）或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。儀器、材料及試劑儀器：培養(yǎng)箱（調(diào)整至 37℃），培養(yǎng)瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術器械、血球計數(shù)板、離心機、水浴箱（37℃）材料：動物組織塊試劑：1640 培養(yǎng)基（含 20%小牛血清或胎牛血清），0.25%胰酶，Hank′s 液，碘酒初代消化培養(yǎng)法1. 準備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺面，紫外線消毒 20 分鐘。開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。2. 布局：點燃酒精燈，安裝吸管帽。3. 處理組織：把組織塊置于燒杯中，用 Hanks 液漂洗 2~3 次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中 30~60 分鐘。4. 剪切：用眼科剪把組織切成 2~3 毫米大小的塊，以便于消化。加入比組織塊總量多30~50 倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結扎瓶口或塞以膠塞。5. 消化：或用恒溫水浴，或置于 37℃溫箱消化均可，消化中每隔 20 分鐘應搖動一次，如用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。6. 分離：在消化過程中見消化液發(fā)混濁時，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細胞團或單個細胞，立即終止消化，隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊。低速（500~1000 轉/分）離心消化液 5 分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液。7. 計數(shù)：用計數(shù)板計數(shù)，如細胞懸液細胞密度過大，再補加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入培養(yǎng)瓶中。對大多數(shù)細胞來說，pH 要求在 7.2~7.4 范圍，培養(yǎng)液呈微紅色，如顏色偏黃，說明液體變酸，可用NaHCO3 調(diào)整。8. 培養(yǎng)：置于 36.5℃溫箱培養(yǎng)，如用 CO2 溫箱培養(yǎng)，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時需要換新塞。初代組織塊培養(yǎng)法1. 剪切：把組織小塊置于小燒杯或青霉素小瓶中，用 Hanks 液漂洗二三次以去掉表面血污，吸靜 Hanks 液，用眼科剪反復剪切 1mm3 塊為止。2. 擺布：用彎頭吸管吸取若干小塊，置于培養(yǎng)瓶中，用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養(yǎng)瓶底部，小塊相互距離以 0.5cm 為宜，每一 25ml 培養(yǎng)瓶底可擺布 20~30 塊。3. 輕輕翻轉培養(yǎng)瓶，另瓶底向上，注意翻瓶時勿另組織小塊流動，塞好瓶塞，置 36.5℃溫箱培養(yǎng) 2 小時左右（勿超過 4 小時），使小塊微干涸。4. 培養(yǎng)：從微箱中取出培養(yǎng)瓶，開塞，46 度斜持培養(yǎng)瓶，箱瓶底腳部輕輕注入培養(yǎng)液少許，然后緩緩再把培養(yǎng)瓶翻轉過來，讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶地上的組織小塊。置溫箱中靜止培養(yǎng)。待細胞從組織塊游出數(shù)量增多后。再補加培養(yǎng)液。傳代培養(yǎng)法原理細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續(xù)生長，同時也將細胞數(shù)量擴大，就必須進行傳代（再培養(yǎng)）。 傳代培養(yǎng)也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經(jīng)過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經(jīng)消化后才能分瓶。材料和試劑1. 細胞：貼壁細胞株2. 試劑：0.25％胰酶、1640 培養(yǎng)基（含 10％小牛血清或胎牛血清）3. 儀器和器材：倒置顯微鏡，培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、吸管、廢液缸等操作步驟1. 吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。2. 向瓶內(nèi)加入胰蛋白酶和 EDTA 混合液少許，以能覆滿瓶底為限。3. 置溫箱中 2~5 分鐘，當發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大后，立即終止消化。4. 吸除消化液，向瓶內(nèi)注入 Hanks 液數(shù)毫升，輕輕轉動培養(yǎng)瓶，把殘余消化液沖掉。注意加 Hanks 液沖洗細胞時，動作要輕，以免把已松動的細胞沖掉流失，如用胰蛋白酶液單獨消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用 Hanks 液沖洗，直接加入培養(yǎng)液。5. 用吸管吸取營養(yǎng)液輕輕反復吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。6. 計數(shù)板計數(shù)后，把細胞懸液分成等份分裝入數(shù)個培養(yǎng)瓶中，置溫箱中培養(yǎng)。無菌操作注意事項1. 操作前要洗手，進入超凈臺后手要用 75%酒精或 0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。2. 點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。3. 操作動作要準確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。4. 不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。5. 瓶子開口后要盡量保持 45℃斜位。6. 吸溶液的吸管等不能混用。深圳市安培生物科技有限公司推出各類進口胎牛血清和高效細胞轉染試劑，均經(jīng)過反復充分驗證，培養(yǎng)細胞效果好且重復性佳。尊敬的客戶您如在訂購過程中遇到任何問題都可以與我司在線客服聯(lián)系尋求幫助，新客戶也可聯(lián)系在線客服申請試用裝。
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